Come eseguire l'analisi mediante PCR: descrizione della procedura

La reazione a catena della polimerasi è nota da 30 anni. È ampiamente usato in molte aree, dall'archeologia alla genetica.

È il metodo PCR che aiuta a stabilire la paternità, ma il più delle volte è usato per identificare varie malattie infettive nel corpo umano.

Come viene eseguita l'analisi PCR e che cos'è? Cercheremo di rispondere a queste domande in dettaglio.

Analisi PCR - che cos'è?

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo di diagnosi genetica molecolare ad alta precisione, che consente di rilevare varie malattie infettive ed ereditarie negli esseri umani, sia negli stadi acuti che cronici, e molto prima che la malattia possa manifestarsi.

Il metodo PCR è assolutamente specifico ed eseguito correttamente non può dare un risultato falso positivo. Cioè, se non c'è infezione, l'analisi non mostrerà mai di cosa si tratta. Pertanto, ora è molto spesso per l'approvazione della diagnosi, un'analisi di PCR aggiuntiva viene presa per determinare l'agente e la sua natura.

Polymerase chain reaction (PCR) nel 1983, sviluppato da Carey Mulllis (USA), per il quale nel 1993 è stato insignito del premio Nobel per la chimica.

Qual è il vantaggio di questo metodo?

La diagnosi con questo metodo consente di trovare il patogeno direttamente nel gene contenuto nei materiali in studio. Questa è l'analisi più accurata delle infezioni genitali, infezioni nascoste, varie malattie trasmesse sessualmente.

Differenze diagnostiche PCR da altri metodi di ricerca di laboratorio sono i seguenti:

• il metodo è finalizzato a identificare il patogeno stesso;
• La diagnosi della PCR è universale: per la rilevazione di diversi patogeni;
• malattie, è sufficiente un solo campione biologico del paziente;
• il metodo è altamente sensibile e non è accompagnato da altre reazioni incrociate.

Inoltre, il vantaggio della diagnostica PCR è che qualsiasi materiale biologico del paziente è adatto per l'analisi: sangue, scarico dai genitali, urina, sperma.

Quali infezioni può rivelare una macchia sulla PCR?

Un grande numero di agenti patogeni può essere presente nel corpo, compresi quelli "nascosti" che non si manifestano da molto tempo.

L'analisi di striscio su PCR consente di rivelare tali infezioni:

Il materiale di prova per PCR è solitamente espettorato, saliva, urina e sangue. Prima dell'analisi, è necessario prepararsi con cura, avendo ricevuto una consultazione preliminare con un medico.

Il sangue per PCR viene solitamente somministrato a stomaco vuoto. Buoni risultati mostrano l'analisi quando il materiale per lo studio viene prelevato dal canale cervicale o dall'uretra. In questo caso, è meglio condurre la diagnostica PCR entro e non oltre un giorno dopo il rapporto sessuale.

Varietà di PCR

La PCR è utilizzata in molte aree per analisi e esperimenti scientifici. Esistono diversi metodi di analisi:

1. Trascrizione inversa PCR (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (inglese)) viene utilizzato per amplificare, isolare o identificare una sequenza nota da una libreria RNA.
2. Inversed PCR (Inverse PCR (Eng.)) - viene utilizzato se solo una piccola parte è nota all'interno della sequenza desiderata. Questo metodo è particolarmente utile quando è necessario determinare sequenze adiacenti dopo l'inserimento del DNA nel genoma.
3. La PCR nested (Nested PCR) viene utilizzata per ridurre il numero di sottoprodotti della reazione. Vengono utilizzate due coppie di primer e vengono eseguite due reazioni successive.
4. La PCR asimmetrica (PCR asimmetrica) viene eseguita quando è necessario amplificare principalmente una delle catene del DNA originale. Utilizzato in alcuni saggi di sequenziamento e ibridazione.
5. PCR quantitativa (PCR quantitativo, Q-PCR (Eng.)) O PCR in tempo reale viene utilizzato per monitorare direttamente la misurazione della quantità di un prodotto PCR specifico in ciascun ciclo di reazione.
6. Step PCR (Touchdown PCR (Eng.)) - l'uso di questo approccio riduce l'effetto del legame non specifico dei primer.
7. PCR specifica per gruppo (PCR gruppo-specifico) - PCR per sequenze correlate all'interno di una o tra specie diverse, utilizzando primer conservativi per queste sequenze.

Se la sequenza nucleotidica della matrice è parzialmente o sconosciuta, è possibile utilizzare primer degenerati, la cui sequenza contiene posizioni degenerate in cui è possibile localizzare qualsiasi base. Ad esempio, la sequenza di primer può essere:... ATH..., dove H è A, T o C.

Quali materiali biologici sono stati studiati?

Il materiale per gli studi sulla PCR, in cui il DNA batterico estraneo può essere rilevato o il DNA o l'RNA del virus, può essere costituito da vari media biologici e fluidi umani:

1. Urina. Può essere usato per l'infezione del tratto urogenitale negli uomini e negli organi urinari nelle donne (negli uomini l'uso di urina come materiale sostituisce il raschiamento epiteliale).
2. Espettorato. È usato per diagnosticare la tubercolosi e meno comunemente per diagnosticare forme respiratorie di clamidia e micoplasmosi. L'espettorato in una quantità di 15-20 ml viene raccolto in una bottiglia sterile (monouso).
3. Fluidi biologici Succo di prostata, pleurico, cerebrospinale, liquido amniotico, liquido articolare, lavaggio broncoalveolare, saliva vengono assunti secondo le indicazioni.
4. Raschiature epiteliali da membrane mucose. Comunemente usato per diagnosticare malattie trasmesse sessualmente (MST), come gonorrea, clamidia, micoplasmosi, ureaplasmosi, tricomoniasi, gardnerellezis, herpetic e altre infezioni che colpiscono le membrane mucose.
5. Le biopsie. Le biopsie più comunemente usate dello stomaco e del duodeno per identificare l'infezione da Helicobacter pylori.
6. Sangue, plasma, siero. Utilizzato per l'analisi PCR di virus dell'epatite B, C, D, G, herpes, CMV, HIV, geni umani.

Come prepararsi per l'analisi?

L'affidabilità del risultato della PCR dipende direttamente dalla correttezza della consegna del materiale per l'esame. Il materiale non dovrebbe essere contaminato, altrimenti il ​​risultato dello studio non sarà obiettivo. Le raccomandazioni più importanti prima di inviare un'analisi PCR sono i seguenti requisiti:

1. L'urina viene consegnata al mattino in un contenitore sterile.
2. Un esame del sangue per l'infezione deve essere assunto a stomaco vuoto al mattino.
3. Non è necessario mostrare l'attività sessuale il giorno prima dell'analisi.

Il risultato dell'analisi sarà pronto in 1,5-2 giorni dopo la procedura. Ci sono situazioni in cui il risultato può essere preparato nello stesso giorno.

Decodifica l'analisi del CRP

Il processo di interpretazione della ricerca presentata si distingue per la sua semplicità. I risultati dell'analisi PCR possono essere ottenuti in 1,5-2x giorni dopo la consegna del materiale. In alcuni casi, il risultato è pronto il primo giorno e questo è ciò che possono significare:

• Un risultato negativo indica che l'agente infettivo è mancante nel materiale diagnosticato.
• Pcr positivo significa che il DNA o RNA dell'agente patogeno è presente nel corpo umano.

In alcuni casi, produrre una determinazione quantitativa di microrganismi. Questo è particolarmente vero per le malattie causate da microrganismi opportunistici. Poiché questi batteri mostrano il loro impatto negativo solo con quantità eccessive.

Inoltre, l'analisi quantitativa della PCR è importante per la scelta delle tattiche terapeutiche e per controllare il trattamento di infezioni virali come virus dell'HIV e dell'epatite.

Quanto è accurata la diagnosi di infezioni da PCR?

Il metodo PCR è caratterizzato da elevata precisione, specificità e sensibilità. Ciò significa che questa analisi è in grado di:

• determinare con precisione la presenza o l'assenza di infezione;
• specificare esattamente quale tipo di infezione (specificità);
• rilevare l'infezione anche con un contenuto di DNA molto basso di microbi in materiale biologico,
• che è stato sottoposto a ricerche (sensibilità).

Analisi PCR: prezzo e tempo

Il prezzo di un'analisi specifica dipende da quale infezione viene controllata. Prezzi e termini approssimativi:

1. STI: 300-500 rubli, tempo - 1 giorno;
2. Virus di Epstein-Barr, papillomavirus umano, virus dell'herpes, citomegalovirus: 300-500 rubli, termini - 1 giorno;
3. Epatite A, B, C, D, G: analisi qualitativa di 650 rubli, analisi quantitativa di 2000 rubli. Termini - fino a 5 giorni;
4. Anticorpi contro il virus dell'epatite C, totale (anti-HCV) - 420 rubli;
5. Anticorpi contro il virus dell'epatite C, IgM (anti-HCV IgM) - 420 rubli;
6. Helicobacter pylori (Helicobacter pylori): 300-400 rubli, termini - 1 giorno;
7. HIV (anticorpi e antigeni) - 380 rubli;
8. HIV RNA, qualitativamente - 3.500 rubli;
9. HIV RNA, quantitativamente - 11.000 rubli.

Per risparmiare denaro, puoi scegliere una serie fissa di analisi. Questo servizio è fornito dalla maggior parte delle cliniche dove è possibile passare l'analisi con il metodo ERP (invitro, onclinics, ecc.)

Diagnosi PCR della tubercolosi

La tubercolosi è un'infezione specifica, la sua attenzione può essere presente nei tessuti umani per anni e quindi diffondersi per diversi mesi. Questa è una malattia cronica i cui regimi terapeutici ottimali sono difficili da selezionare. Uno dei motivi di ciò è la diagnosi tardiva, quando i micobatteri, mentre nel corpo umano, si sono già adattati a molti farmaci.

Quali sono i moderni metodi di diagnosi? Diagnostica PCR - che cos'è? Come viene condotta questa ricerca? In quali casi viene diagnosticata la tubercolosi con questo metodo e qual è la sua essenza?

Che cos'è la diagnostica PCR

Questo è uno dei metodi più moderni per diagnosticare non solo le malattie, ma anche il rilevamento di materiale biologico. La diagnostica della PCR è stata inventata relativamente di recente. Circa 30 anni fa, nel 1983, un biochimico americano, Carey Banks Mullis, propose un complesso schema di recupero per il materiale biologico di microrganismi in un segmento breve. Grazie alla sua scoperta, lo scienziato ha ricevuto il premio più alto - il premio Nobel.

Che cos'è - diagnosi di PCR delle infezioni? La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una diagnosi del rilevamento di malattie virali, basata su metodi di ingegneria genetica. È ampiamente usato in microbiologia medica, immunologia e virologia. Il metodo è universale e aiuta a fare una diagnosi con una piccola quantità di materiale. Un'infezione può essere rilevata letteralmente nelle prime ore di infezione, molto prima che compaiano i primi sintomi della malattia.

Il metodo consiste nell'ottenere dal materiale di una persona malata non il patogeno stesso, ma frammenti del genoma (particelle di DNA), la sua biosintesi con successiva determinazione a quale classe di microrganismi il materiale genetico ottenuto appartiene mediante metodi genetici molecolari.

Nonostante il fatto che si tratti di un processo complesso, ci vuole molto meno tempo rispetto a molti metodi biologici per rilevare agenti infettivi. Entro poche ore, un microrganismo può essere rilevato mediante PCR. Per fare questo, non è necessario isolarlo dall'ambiente (sangue, liquido cerebrospinale, espettorato) e farlo crescere a lungo sui terreni di coltura artificiale. È sufficiente che un piccolo frammento del filamento di DNA dell'agente infettivo sia presente nel materiale in esame.

La base della reazione è la possibilità in condizioni artificiali (in vitro) di creare la sintesi di molecole di acido nucleico dell'agente infettivo.

Cosa è necessario per la PCR?

1. I primer sono i segmenti di DNA da cui inizia la biosintesi o la creazione.
2. Nucleotidi o composti complessi che sono alla base di una molecola di DNA o RNA.
3. La reazione a catena della polimerasi è impossibile senza la presenza di polimerasi, che è un enzima che accelera la PCR.

Le fasi della diagnostica PCR

Come viene condotta la diagnosi molecolare mediante PCR? La procedura è semplice e richiede poco tempo, tenendo conto della raccolta di materiale.

1. Prima di iniziare lo studio, prendono il materiale biologico necessario - questo è l'acqua di lavaggio bronchiale, il sangue, il contenuto gastrico, l'espettorato. Il tipo di materiale biologico dipende dal presunto agente patogeno.
2. Denaturazione o distruzione della struttura primaria del DNA, che consiste in due catene. L'essenza di questo stadio è di separare i due circuiti sotto l'influenza della temperatura elevata (il massimo è 98 ºC, che non dura più di due minuti).
3. Nella fase successiva della PCR, chiamata ricottura, la temperatura viene ridotta di diversi gradi in modo che il primer si leghi al filamento del DNA.
4. Allungamento, durante il quale la sintesi delle molecole desiderate avviene direttamente.

Di conseguenza, solo 25-30 di questi cicli ricevono il numero necessario di copie del DNA del microrganismo, che sono facilmente riconoscibili.

La PCR richiede la diagnosi di tubercolosi?

Non è possibile che tutte le persone con sospetta tubercolosi eseguano la PCR, poiché il metodo richiede attrezzature costose. Non tutte le cliniche pubbliche possono permettersi di comprarlo. Inoltre, è successo che anche i soliti metodi di diagnosi di un'infezione nella maggior parte dei casi si giustificano da soli.

Questi includono:

• indagine paziente, presa della storia;
• esame completo della persona;
• uno studio che utilizza il test alla tubercolina di Mantoux;
• radiografia o fluorografia;
• diagnostica del computer, se necessario;
• metodi di ricerca microbiologica: microscopia a striscio ed esame batteriologico dell'espettorato.

La PCR per tubercolosi viene eseguita in casi particolari quando è difficile fare una diagnosi o non è possibile eseguire altri metodi strumentali.

Nonostante l'abbondanza di metodi diagnostici, l'incidenza della tubercolosi continua a crescere. Attualmente, non c'è solo la sua crescita, ma anche altre caratteristiche:

• la malattia si presenta spesso in forma grave;
• il numero di casi fatali aumenta;
• sempre più resistenti alla moderna chemioterapia sono forme diagnosticate della malattia.

La riluttanza delle persone stesse a sottoporsi annualmente ad esami medici di routine, il rifiuto della vaccinazione porta alla diffusione della tubercolosi. In tali condizioni, abbiamo bisogno di metodi di ricerca rapidi, informativi ed efficaci che dovrebbero essere accessibili a bambini e adulti. Tutti i metodi diagnostici sopra riportati sono molto inferiori alla PCR.

Benefici della diagnosi di tubercolosi con PCR

Questa ricerca, anche se nuova, si è dimostrata efficace, specialmente in casi controversi in cui è impossibile fare una diagnosi per una serie di motivi.

Grazie alla PCR, è molto più facile rilevare l'agente eziologico della tubercolosi nel materiale di prova.

I vantaggi della diagnostica PCR sono i seguenti.

1. Questa è una rapida analisi. Un piccolo frammento della molecola del DNA può essere utilizzato per diagnosticare in poche ore (circa cinque), che viene utilizzato con successo in situazioni di emergenza quando, ad esempio, prima di un'operazione è necessario determinare se una persona è malata di tubercolosi.
2. L'analisi PCR è consentita nel caso in cui altri metodi non siano disponibili o vietati (per la rilevazione della tubercolosi polmonare, a volte è necessario prendere diverse immagini radiografiche, che saranno una grande dose di radiazioni).
3. Con l'aiuto della PCR, qualsiasi ambiente biologico viene esaminato per la presenza di un agente patogeno in esso. Ad esempio, è possibile condurre uno studio sul liquido cerebrospinale, se vi è il sospetto di meningite tubercolare.
4. Diagnosi PCR consentita di malattie infettive nei bambini, perché il metodo è sicuro.
5. Ti consente di identificare l'agente patogeno in qualsiasi fase della malattia.
6. L'elevata sensibilità della PCR consente di rilevare il Mycobacterium tuberculosis, anche se nel materiale biologico sono presenti solo pochi microrganismi.
7. È bene effettuare per la diagnosi di recidiva della malattia.

Dopo tutto la PCR letta sembra un metodo diagnostico quasi perfetto, che dovrebbe rendere tutti sospettati di tubercolosi. Ma ci sono anche degli svantaggi qui, devono essere presi in considerazione.

Svantaggi della PCR nella diagnosi di tubercolosi

Nel nostro tempo, tale diagnostica è più rara della regolarità. E per questo c'è una ragione.

1. Questo è un metodo di ricerca costoso. In molte cliniche, l'attrezzatura per la PCR è assente a causa del suo alto costo, ma l'analisi può essere ancora eseguita in laboratori pagati.
2. Immediatamente dopo il trattamento, nel corpo umano possono ancora essere presenti micobatteri morti o che vivono in piccole quantità (il risultato sarà positivo durante la diagnostica PCR), quindi il metodo sarà inaffidabile in questo momento, non ha senso eseguirlo.
3. Le mutazioni dei micobatteri si traducono in PCR inefficace - una normale sequenza di filamenti di DNA non può essere sintetizzata.
4. È necessario scegliere l'ambiente giusto per lo studio, il sangue viene prelevato solo se si sospetta di essere infetto (sepsi), non è necessario prendere l'espettorato se c'è una questione di tubercolosi degli organi del sistema nervoso. In questo caso, la PCR non sarà in grado di rilevare l'agente patogeno e la diagnosi sarà poco informativa.

Indicazioni per la rilevazione della tubercolosi mediante analisi PCR

La diagnosi di PCR della tubercolosi viene eseguita più spesso in casi controversi. Quando i medici riferiscono questo studio?

1. Se è difficile fare una diagnosi usando i soliti metodi disponibili, ma c'è stato un contatto con un paziente affetto da tubercolosi.
2. Nel caso in cui una persona non possa essere consegnata a una clinica per sottoporsi a test di routine per la tubercolosi, è più facile esaminarla utilizzando la PCR, poiché l'espettorato per il test può essere consegnato in un barattolo e la diagnosi viene confermata entro poche ore.
3. Se una persona sta per avere un'operazione di emergenza ed è urgente scoprire se è malato di tubercolosi.
4. Se necessario, una donna incinta è anche meglio esaminare la tubercolosi mediante PCR, poiché il metodo è sicuro.
5. Su base retribuita, chiunque non sia stato diagnosticato la tubercolosi è stato confermato utilizzando metodi batteriologici e fluoroscopia. Questo accade quando la lesione nei polmoni è impercettibile nell'immagine diretta e la persona durante l'espettorato per lo studio non può seguire le raccomandazioni per la corretta raccolta del materiale. In questo caso, la persona è preoccupata per tutti i sintomi caratteristici della tubercolosi polmonare.
6. Quando ci sono dubbi sui risultati del test di Mantoux.
7. È preferibile fare diagnosi di PCR della tubercolosi nei bambini. La procedura è sicura, non crea ulteriore esposizione alle radiazioni ed è efficace nel rilevare forme difficili da diagnosticare della malattia.

La diagnosi tempestiva della tubercolosi è la chiave per un trattamento adeguatamente prescritto e per ridurre la diffusione della malattia. Spesso, i metodi familiari di rilevamento della malattia non sono sempre efficaci. Pertanto, la PCR oggi è uno dei metodi più affidabili e sicuri per rilevare l'infezione nelle prime fasi del suo sviluppo.

Analisi PCR

La PCR (polymerase chain reaction) è di gran lunga il metodo più rapido e affidabile per diagnosticare malattie infettive.

Il principio del metodo di reazione a catena della polimerasi è stato sviluppato da Kary Mullis nel 1983. Per la sua scoperta, K. Mullis nel 1993 ha ricevuto il premio Nobel per la chimica.

Il metodo PCR consente di ottenere un significativo aumento delle piccole concentrazioni di alcuni frammenti di acido nucleico (DNA) nel materiale biologico (campione). Il metodo si basa sulla copia multipla selettiva (amplificazione) di una determinata sezione di DNA utilizzando enzimi in condizioni artificiali.

I vantaggi del metodo diagnostico della PCR come metodo diagnostico per le malattie infettive

Rilevazione diretta di agenti patogeni

Molti metodi diagnostici tradizionali, come il saggio immunoenzimatico, rilevano i marcatori proteici che sono i prodotti dell'attività vitale degli agenti infettivi, che fornisce solo una prova indiretta della presenza di infezione. L'identificazione di una regione specifica del DNA del patogeno mediante PCR fornisce un'indicazione diretta della presenza dell'agente patogeno.

Alta specificità

L'elevata specificità del metodo PCR è dovuta al fatto che nel materiale in esame viene rilevato un frammento di DNA univoco. La specificità è determinata dalla sequenza nucleotidica dei primer, che esclude la possibilità di ottenere risultati falsi, in contrasto con i metodi immunologici di analisi, in cui sono frequenti gli errori in relazione agli antigeni cross-reattivi.

Alta sensibilità

Il metodo PCR consente di rilevare anche singole cellule di batteri o virus. L'analisi PCR rivela la presenza di patogeni di malattie infettive nei casi in cui altri metodi (immunologici, batteriologici, microscopici) non possono farlo. La sensibilità dell'analisi PCR è di 10-100 cellule per campione (la sensibilità dei test immunologici e microscopici è di 103-105 cellule).

Universalità della procedura per il rilevamento di vari agenti patogeni

Il materiale per lo studio di PCR è il DNA del patogeno. Il metodo si basa sulla rilevazione di un frammento di DNA o di un RNA specifico per un particolare organismo. La somiglianza della composizione chimica di tutti gli acidi nucleici consente l'uso di metodi unificati di ricerca di laboratorio. Ciò rende possibile diagnosticare diversi agenti patogeni da un singolo saggio biologico.

Alto tasso di risultato dell'analisi

Per l'analisi della PCR non è richiesto l'isolamento e la coltivazione della coltura del patogeno, il che richiede molto tempo. Il metodo unificato di elaborazione del biomateriale e il rilevamento dei prodotti di reazione e l'automazione del processo di amplificazione consentono di eseguire un'analisi completa in 4-5 ore.

La capacità di diagnosticare non solo infezioni acute ma anche latenti

Il metodo PCR è particolarmente efficace per diagnosticare forme di microrganismi difficili da coltivare, incolte e persistenti che si incontrano spesso in infezioni latenti e croniche, poiché questo metodo evita le difficoltà associate alla crescita di tali microrganismi in laboratorio. L'uso della diagnostica PCR è anche molto efficace contro i patogeni con elevata variabilità antigenica e parassiti intracellulari.

Quanto è efficace il test dell'espettorato per la tubercolosi mediante PCR?

Per identificare i bastoncini di Koch nell'uomo, vengono utilizzati diversi metodi diagnostici. Grazie a lui, la patologia può essere rilevata anche nella fase iniziale, il che aumenta le possibilità di recupero del paziente. L'analisi dell'espettorato per la tubercolosi è una tecnica che è più apprezzata ed è piuttosto efficace. Che cos'è e quanto costa un'analisi del genere?

Qual è l'analisi dell'espettorato tramite PCR?

PCR è sinonimo di reazione a catena della polimerasi. Questo metodo è efficace contro le malattie infettive. Per stabilire una diagnosi chiara, non è necessario raccogliere una grande quantità di biomateriale e attendere a lungo, come nel caso della semina dell'espettorato.

Il metodo si basa sull'ottenimento di DNA di particelle di microrganismi. Inoltre, la ricerca genetica molecolare determinerà quale tipo di microrganismi includere il materiale disponibile. In condizioni di provetta, uno specialista sintetizzerà le molecole di batteri e trarrà le conclusioni appropriate in poche ore.

efficacia

L'analisi dell'espettorato per Mycobacterium tuberculosis è efficace quando la bacchetta di Koch ha colpito il sistema respiratorio. In questo caso, la malattia può essere facilmente identificata, anche nelle prime ore di infezione.

Ma l'analisi dell'espettorato non mostrerà un risultato affidabile se la tubercolosi è presente:

• ossa;
• cervello, midollo spinale;
• sistema nervoso;
• articolazioni, ecc.

Il phthisiatrician sarà in grado di determinare il tipo di malattia, tenendo conto dei sintomi presenti e facendo affidamento sui risultati di analisi generali e di altro tipo.

È anche inappropriato per un tale metodo di ricerca nel caso in cui sia necessario condurre un'analisi di controllo dopo il trattamento terapeutico della malattia. Il risultato sarà positivo, come nel corpo, in ogni caso, ci sono ancora IBC vivi o morti. È meglio dare la preferenza a un'altra procedura diagnostica.

Controindicazioni al metodo

Come tale, non ci sono controindicazioni per il test dell'espettorato per la tubercolosi mediante PCR. Ci sono dei limiti. Come accennato in precedenza, non è necessario eseguirlo dopo il trattamento della tubercolosi. I risultati non saranno utili. Qui è desiderabile ricorrere a una diagnosi diversa.

Inoltre, non ci sono altri ostacoli per questa diagnosi. L'espettorato può essere esaminato in qualsiasi categoria di età e per qualsiasi malattia associata. Anche se non c'è abbondanza di espettorato, l'analisi può essere eseguita prendendo il muco usando la broncoscopia.

vantaggi

In questo metodo, la massa di vantaggi, questi includono:

1. Elevata specificità e sensibilità. Viene rilevato solo l'agente eziologico della tubercolosi. Non ci può essere una risposta falsa se tutte le sfumature della procedura sono prese in considerazione. I micobatteri vengono rilevati anche quando il loro numero minimo. Anche se ci sono 10 cellule anormali nel materiale raccolto, l'infezione verrà rilevata.
2. La velocità di ottenere una risposta. Quanta analisi è fatta? Dopo 3-5 ore puoi ottenere il risultato. Non è necessario fare cultura dell'espettorato per la tubercolosi e questo riduce il tempo.
3. Puoi identificarti come un'infezione nascosta e quella che è in forma acuta.
4. Non ci sono controindicazioni assolute. Ciò rende possibile eseguire la procedura per tutti senza eccezioni (anche per i bambini piccoli), e soprattutto quando altri metodi non sono risolti.
5. Con l'aiuto della diagnostica PCR vengono studiati vari biomateriali (urina, feci, sangue, saliva, liquido cerebrospinale, ecc.).
6. Il metodo rivela la tubercolosi nelle fasi iniziali, nelle prime ore dopo l'infezione.

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carenze

Oltre ai lati positivi, ci sono anche quelli negativi. Questo è:

1. L'analisi PCR è un costoso "piacere". Inoltre, l'attrezzatura necessaria per la sua implementazione non è disponibile in tutti i centri medici. Nelle cliniche è raramente presente, dal momento che il suo valore è anche grande. Se parliamo di cliniche private, allora sì, puoi trovare questo tipo di diagnosi. Consenti a se stesso, purtroppo, non tutti possono.
2. Mostra un risultato falso positivo in quelle persone che hanno recentemente subito un trattamento di tubercolosi.
3. Se MBC è mutato, il metodo può anche dare risultati falsi.
4. Se il materiale viene raccolto in modo errato o lo specialista che conduce la ricerca ha un livello di qualifica insufficiente, è possibile anche un malfunzionamento. In alcuni casi, la procedura dovrà essere ripetuta più volte e ogni volta che il pagamento viene ripetuto.

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Preparazione per l'analisi

Affinché il materiale sia di alta qualità, deve essere assemblato correttamente e preparato per esso correttamente.

Ci sono alcune regole per la raccolta di espettorato per la tubercolosi. L'algoritmo di azione è il seguente:

1. Anche alla vigilia, alla sera una persona ha bisogno di bere un espettorante (se l'espettorato si allontana male). Anche se non fosse d'aiuto, l'inalazione dovrebbe essere effettuata sulla base di un farmaco dilutante ed espettorante. In assenza di escreato, il paziente viene preso di mira per la broncoscopia. È durante questa procedura che viene preso il materiale per lo studio.
2. Acquista un contenitore speciale in anticipo. È sterile e a tenuta d'aria, quindi non è possibile posizionare nulla in più né aprire in anticipo.
3. La stanza in cui verrà raccolto l'espettorato dovrebbe essere ben ventilata. È necessario aprire finestre, porte, accendere il cofano. Un'altra buona opzione è prendere un po 'd'aria fresca (ad esempio, sul balcone o nel cortile).
4. Immediatamente prima della procedura, devi avvisare tutti in modo che nessuno entri nella stanza dove tutto accadrà. Non ci dovrebbero essere microparticelle extra nel biomateriale - questo è importante.
5. Mangiare prima di raccogliere non è raccomandato.
6. Risciacquare la bocca e la gola.
7. La saliva è sputata. La sua capacità dovrebbe ridursi al minimo.
8. Tossendo, una persona estrae la flemma e la sputa in un contenitore preparato. Dopo la procedura, chiudere saldamente il coperchio e portare il campione in laboratorio.

Come raccogliere l'espettorato dovrebbe dire al medico. Se il paziente non ha il coraggio di farlo da solo, gli operatori sanitari vengono in soccorso. Durante la manipolazione, indossano una speciale maschera protettiva. Raccogli l'espettorato sarà in una stanza speciale, dove non c'è modo per gli estranei. Se il paziente non può venire in clinica, lo specialista viene a casa sua e aiuta a raccogliere il muco.

Se si esegue la broncoscopia, il paziente viene iniettato nella trachea con un dispositivo - un broncoscopio. È con il suo aiuto che il materiale è preso.

Per affidabilità, è consigliabile passare tre volte l'analisi, ossia:

• al mattino a stomaco vuoto;
• dopo la prima volta dopo 4-5 ore;
• 24 ore dopo il primo studio e anche prima dei pasti.

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Come viene eseguita questa analisi?

Passare un test espettorato per la tubercolosi è solo una parte del lavoro. Avanti. Molto dipende da quanto preparato uno specialista.

Il corso dello studio è il seguente:

1. Lo specialista procede alla distruzione della struttura primaria del DNA (denaturazione). Ci sono due catene qui. A temperature elevate, sono separati.
2. Nella fase successiva, la temperatura viene ridotta (ricotta). Questo è necessario per la connessione del filamento di DNA con il primer.
3. Il terzo stadio è l'allungamento. Qui vengono sintetizzate le molecole necessarie.

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Decodifica risultati

Mycobacterium tuberculosis nell'espettorato mediante PCR può essere rilevato o meno. Un risultato positivo si basa sul fatto che nel biomateriale c'è DNA di bastoncini di Koch. Questo suggerisce che la persona è infetta. Con un negativo - 98% del fatto che il soggetto non è infetto.

Gli indicatori possono essere giudicati in base a:

• quale fase della patologia (latente o attiva);
• quanto il corpo è interessato;
• se il trattamento scelto è efficace in un caso particolare.

Tieni presente che nulla è approfondito. Pertanto, potrebbe esserci un risultato falso positivo o falso negativo. Per garantire la sua correttezza, sono raccomandate altre procedure diagnostiche o la PCR viene eseguita due volte (tre volte).

Analisi dei costi in diversi centri

Puoi dare l'espettorato per la PCR in diverse cliniche. Diamo esempi di diversi centri popolari di Mosca con le politiche dei prezzi.

Metodi per testare l'espettorato per la tubercolosi

L'analisi dell'espettorato per la tubercolosi è inclusa nell'insieme delle misure diagnostiche necessarie per identificare e chiarire la diagnosi. Il contenuto di escreato contribuirà a rendere un regime di trattamento competente.

Come superare un test dell'espettorato per la tubercolosi

I medici hanno sviluppato regole per l'analisi. La saliva viene raccolta al mattino, prima che la persona abbia fatto colazione. Innanzitutto, il paziente esegue le procedure igieniche:

• pulizia dello smalto dei denti;
• risciacquo completo con acqua pulita del cavo orale e della faringe.

Quindi inizia la consegna immediata del materiale per l'analisi. Come superare un test dell'espettorato? Requisiti per la procedura:

1. La preparazione inizia in anticipo, di sera. Il paziente è incoraggiato a prendere farmaci speciali che renderanno la secrezione polmonare più naturale. Questi sono composti espettoranti e diradanti. Se tali procedure non aiutano, effettuare l'inalazione con una composizione farmaceutica per l'espettorazione.
2. Preparare i contenitori per espettorato. Il muco deve essere raccolto in piatti sterilizzati, chiudendo strettamente, strettamente.
3. Prima della consegna, tossire e sputare in un contenitore. Il volume di saliva non dovrebbe essere grande, richiede espettorato dalla laringe. I batteri del cavo orale sono estranei all'analisi.
4. Raccogli la saliva in una stanza con un'eccellente ventilazione. L'analisi viene effettuata aprendo lo specchio di poppa, azionando il cofano. Si consiglia di aprire le finestre o uscire all'aria aperta.

Durante la procedura nella stanza è vietato entrare. Gli estranei possono contribuire alla microflora dell'ufficio, e quindi all'espettorato, formazioni patologiche. I medici ricevono analisi in una maschera speciale (respiratore).

Analisi dell'espettorato per la trascrizione della tubercolosi

La decodifica inizia guardando l'aspetto del muco. La patologia caratterizza il cambiamento di colore: diventa scuro, con mescolanze visibili di sangue. Il colore non è l'indicatore principale. L'espettorato diventa scuro bevendo vino rosso, passione per il caffè. Alcuni farmaci e bevande colorate cambiano l'aspetto del muco.

Il materiale raccolto è decifrato da due indicatori, cioè i medici ottengono due risultati:

Risposta positiva

L'analisi dell'espettorato risultante conferma la presenza della malattia nel corpo. Che conferma questo:

• materiale estraneo o inclusioni sconosciute;
• la presenza di coaguli di muco;
• strisce visibili;
• odore sgradevole purulento o infettivo;
• pus.

Il metodo di ricerca macroscopico fornisce altri dati:

• convoluzioni fibrinose;
• Formazioni di bacchette per lenti Koch;
• prodotti dalla decomposizione della decomposizione di sostanze batteriche;
• Resti del processo patologico nel tessuto polmonare.

Un risultato positivo rivela una maggiore quantità di composti proteici. Raggiunge 100-120 g / l.

Un altro metodo microscopico consente di identificare altri elementi pericolosi:

• macrofagi alveolari;
• composizione sovrastimata di leucociti;
• alto tasso di linfociti.

Per la tubercolosi, una persona cerca spesso di sputargli dalla bocca. L'emottisi aumenta la formazione di globuli rossi. Il volume di saliva in bocca è tale che una persona non può ingoiarlo senza accorgersene. È più che in uno stato sano.

Risposta negativa

Lo studio mostra che il numero di leucociti è piccolo, corrisponde alla norma. Anche i microbatteri non vengono rilevati. Se il paziente non si sente in salute, lo specialista prescriverà un ulteriore esame. È possibile che la malattia sia associata a una malattia polmonare. Tipi e metodi di diagnostica aggiuntiva dipendono dai sintomi e dalle condizioni del paziente.

Com'è lo studio del muco

La tubercolosi è un pericoloso effetto patologico sul tessuto polmonare, si osserva la loro disintegrazione. L'analisi viene effettuata con diversi metodi. Il più comune - ELISA (immunodosaggio). L'essenza del metodo:

1. Gli anticorpi vengono aggiunti alla soluzione in cui viene inserita una parte dell'espettorato.
2. Controlla la concentrazione di antigeni, rispetto alla norma di un corpo sano.
3. Determina l'attività dell'ambiente patologico.
4. Diagnosticato.

La seconda versione della ricerca di laboratorio è RIFIUTI. Per il metodo prendi attrezzature mediche speciali. L'essenza della ricerca hardware:

1. Nel microambiente iniettato di espettorato per il tipo di infezione previsto.
2. L'apparato inizia a crescere a una certa temperatura da ceppi di batteri.
3. Il biossido di carbonio viene prodotto nel processo e i sensori lo raccolgono.
4. Il gas si combina con la tintura.
5. Sull'indice di fluorescenza si possono trarre conclusioni sul tipo di malattia.

Il modo più semplice è culturale. Flemma seminata in un ambiente speciale. Il medico esamina i tipi di colonie di formazioni microbiche. Il metodo è il più lungo, ma consente di provare la diagnosi. È usato molto raramente, proprio a causa di un lungo periodo di tempo, che non è sempre appropriato per il paziente.

Analisi dell'espettorato per la tubercolosi

PCR è l'abbreviazione della reazione a catena polimerasi termine medico. La diagnostica è uno degli ultimi sviluppi degli scienziati. E 'stato aperto nel 1983, l'importanza della scoperta è apprezzata nel mondo, lo scienziato ha ricevuto il più alto riconoscimento - il premio Nobel.

Il metodo si basa sull'uso dell'ingegneria genetica. La sua versatilità nella necessità di una piccola quantità di materiale per una diagnosi accurata. Identificare l'infezione da tubercolosi è davvero nelle prime ore di infezione, senza attendere lo sviluppo della malattia.

L'essenza del metodo che è la polimerasi:

• un paziente prende un frammento di particelle di DNA;
• condurre la sintesi biologica del materiale;
• determinato dalla classe di microrganismi.

Il processo è tecnologicamente complesso, coinvolge l'esame genetico molecolare. La PCR per la tubercolosi richiede letteralmente alcune ore. Il tempo richiesto per altri metodi non può essere paragonato a lui in velocità. Dopo aver superato l'analisi, il paziente sta aspettando la rilevazione dell'agente causale. Il processo che sta alla base solo di uno specialista può capire. Una persona comune non capisce la complessità del metodo.

Come è la diagnosi dei test di tubercolosi:

1. Prendi il materiale necessario per l'analisi. Cosa potrebbe essere: sangue, stomaco, espettorato, acqua, lavato con i bronchi.
2. Il tipo di materiale viene selezionato in base al tipo di infezione da agente patogeno possibile.
3. Il prossimo passo è studiare la connessione della catena. Due catene sono soggette a temperature elevate fino a 98 gradi. Lo stadio è chiamato denaturazione (distruzione della catena strutturale del DNA). Tempo di esposizione alla temperatura - fino a 2 minuti.
4. Il prossimo stadio è ricottura. La temperatura è ridotta, il primer è autorizzato a connettersi al filamento del DNA.
5. Di conseguenza, si verifica l'allungamento - la sintesi delle molecole necessarie per il processo.

Per tale analisi è richiesta un'attrezzatura speciale. È costoso, quindi non è disponibile in nessuna struttura sanitaria. La PCR viene eseguita in casi difficili, quando non esiste un risultato esatto dei metodi diagnostici convenzionali, è impossibile eseguire metodi strumentali per verificare le condizioni del paziente.

I vantaggi della tecnologia PCR:

1. La velocità di ottenere il risultato. Circa 5 ore un medico ha dati precisi. Questa velocità consente di aiutare il paziente in caso di emergenza. Più spesso, è il periodo preoperatorio.
2. Consentito quando non è possibile utilizzare altri metodi. Ad esempio, la ripetizione frequente dei raggi X porta alle radiazioni. La PCR non è pericolosa per il paziente.
3. Puoi esplorare qualsiasi ambiente biologico. Vengono identificate anche forme complesse di tubercolosi.
4. Il metodo è sicuro, quindi adatto ai bambini.
5. L'infezione è rilevata in qualsiasi momento.
6. La PCR non consente di nascondere anche un piccolo numero di micro-formazioni batteriche.
7. Adatto per il controllo di possibili recidive di tubercolosi.

Quanto fa l'analisi dell'espettorato per la tubercolosi

I campioni vengono presi più di una volta. Le ripetizioni escludono la possibilità di errori o di ottenere materiale di scarsa qualità che non riflette la vera posizione e condizione del paziente. Quante volte per raccogliere l'espettorato, dire al medico curante. L'opzione migliore è tre volte al giorno. A volte possono essere richiesti campioni aggiuntivi. Durante quali periodi di tempo raccolgono:

1. Prima di mangiare al mattino.
2. 3-4 ore dopo il primo test.
3. Il secondo giorno, anche prima dei pasti.

La tubercolosi è una malattia pericolosa che può colpire il corpo di qualsiasi persona. Ci sono molte situazioni di infezione. Con qualsiasi sospetto sulla possibilità di infezione, non aspettare sintomi luminosi. Dovrebbe essere testato, esaminato e in tempo per iniziare il trattamento.

Diagnosi PCR della tubercolosi nei bambini e negli adulti: indicazioni per

L'Organizzazione Mondiale della Sanità ha riconosciuto 20 anni fa che il tasso di diffusione della tubercolosi era fuori controllo e raggiungeva le dimensioni di un'epidemia. Da allora, la situazione non è migliorata. Più di un milione di casi di malattia vengono diagnosticati ogni anno, di cui quasi un quarto è fatale. Nell'ultimo decennio, il tasso di incidenza tra i bambini è aumentato, la maggior parte delle forme della malattia non si prestano alla terapia antibiotica standard.

Oggi, uno dei compiti globali per la medicina è lo sviluppo di tali metodi diagnostici che permetteranno di identificare la patologia prima dell'inizio dei sintomi clinici pronunciati. Uno di questi è la reazione a catena della polimerasi (PCR) per la tubercolosi, che aiuta a rilevare i bastoncini che causano la malattia di Koch nel sangue, nell'espettorato e in altri fluidi biologici.

Diagnosi di tubercolosi

I test di screening mirano a individuare pazienti, portatori di tubercolosi e prevenire la diffusione dell'infezione nella società. Per i bambini di età inferiore ai 14 anni, il test di Mantoux viene utilizzato in modo massiccio. Questo è un test immunologico in cui viene iniettata una dose di tubercolina per via sottocutanea - una miscela complessa del materiale genetico di diversi tipi di micobatteri. L'aspetto di una reazione pronunciata indica un processo infettivo che si verifica attivamente.

Per l'esame preventivo negli adulti che usano la fluorografia o i raggi x. Questi metodi aiutano a visualizzare le lesioni patologiche nel tessuto polmonare. Tuttavia, provoca difficoltà nel differenziare la tubercolosi da un'altra patologia organica (neoplasie maligne e benigne, processi infiammatori, invasioni parassitarie, danni polmonari professionali).

Per chiarire la struttura e le dimensioni del focus patologico, potrebbero essere necessari ulteriori studi strumentali:

• radiografia mirata;
• tomografia computerizzata;
• imaging a risonanza magnetica.

Metodi per la diagnosi di tubercolosi

In caso di risultati dubbi e per la nomina di una terapia adeguata, è necessario disporre di metodi diagnostici più accurati che consentano di isolare l'agente patogeno. L'esame microscopico e batteriologico dell'espettorato viene utilizzato per confermare a lungo le forme polmonari della tubercolosi.

Negli ultimi anni, l'incidenza del micobatterio di vari organi e sistemi - i reni, le ossa, l'intestino, la pelle - è diventata più frequente. Per identificare queste forme di tubercolosi, esami ecografici, coltura di urine e feci, si possono usare esami endoscopici.

La diagnostica della PCR per la tubercolosi contribuirà a confermare la presenza di bastoncini di Koch nel sangue, nonché la sua sensibilità a determinati farmaci. Questo è un metodo altamente efficace basato sulla rilevazione del materiale genetico batterico in vari fluidi biologici.

Specificità e indicazioni

La reazione a catena della polimerasi è un metodo diagnostico microbiologico altamente sensibile, basato sui principi dell'ingegneria genetica. Per confermare la presenza di un agente patogeno in un materiale biologico, è sufficiente rilevare un frammento di acido nucleico unico per esso. PCR per tubercolosi in grado di rilevare i batteri nel sangue, espettorato, urina.

Al momento, ha sviluppato diversi metodi di analisi. I più popolari tra questi sono i seguenti:

• PCR in tempo reale;
• tecnologia microfluidica;
• sequenziamento e pirosequenziamento.

PCR in tempo reale

I laboratori utilizzano più spesso la reazione a catena della polimerasi in tempo reale, poiché riduce il numero di risultati falsi positivi e il processo di analisi richiede poco tempo.

Dato il gran numero di forme nascoste della malattia e l'inefficacia dei metodi diagnostici standard, la PCR è sempre più utilizzata. Lo scopo di questa analisi è mostrato a:

• identificazione di aree sospette sulla radiografia;
• risultati dubbi del test alla tubercolina;
• l'impossibilità di condurre analisi microscopiche e batteriologiche dell'espettorato in persone in gravi condizioni;
• condurre interventi chirurgici quando è necessario assicurarsi rapidamente che non ci siano infezioni;
• l'inammissibilità all'uso della fluorografia, dei raggi X o della tomografia computerizzata (ad esempio, nelle donne in gravidanza e durante l'allattamento al seno, in caso di esposizione eccessiva alle radiazioni);
• sospetta tubercolosi extrapolmonare (si raccomanda di usare non solo il sangue ma anche la flemma).

La diagnostica PCR della tubercolosi si è dimostrata efficace nell'esame dei bambini, a causa della mancanza di esposizione aggiuntiva e di risultati rapidi.

Procedura di preparazione e analisi

Non è richiesta una preparazione speciale per la PCR del sangue. Tuttavia, al fine di evitare complicazioni del prelievo di sangue e al fine di ottenere materiali di alta qualità, è necessario attenersi alle seguenti regole generali:

• l'analisi dovrebbe essere presa al mattino non prima di 2 ore dopo il risveglio;
• Dovrebbe limitare l'assunzione di cibi grassi e fritti un giorno prima del prelievo di sangue;
• astenersi dal mangiare, tè e caffè per 8-9 ore, è permesso bere acqua pulita;
• Non fumare per almeno 3-4 ore.

Nel caso di farmaci permanenti (ormoni, anticoagulanti, farmaci antinfiammatori, antibiotici, fluidificanti del sangue), è necessario informare l'assistente di laboratorio di questo.

Al momento della consegna dell'espettorato, dovresti lavarti bene i denti e sciacquarti la bocca più volte. Raccogli materiale in un contenitore sterile. Per risultati migliori, un espettorante o agente mucolitico può essere assunto la sera.

La diagnosi stessa consiste di diverse fasi.

Materiale di recinzione. Può essere eseguito in laboratorio e da remoto. Alcuni tipi di materiale che il paziente raccoglie indipendentemente (urina, flemma).

La distruzione della struttura degli acidi nucleici (denaturazione delle molecole di DNA e RNA). Per fare questo, il materiale di prova viene riscaldato ad una temperatura di 98 gradi e tenuto per diversi minuti. Come risultato, la doppia elica si svolge, si formano molecole a filamento singolo.

Scherzo. Dopo aver aggiunto un primer (una breve sezione di acido nucleico), la temperatura diminuisce di diversi gradi, viene attivata la polimerasi.

Elognatsiya. La temperatura è portata al livello ottimale, l'attività dell'enzima raggiunge il massimo e la seconda catena è completata secondo la regola di complementarità di Chargaff.

Per completare lo studio, è necessario sintetizzare il numero richiesto di molecole di DNA - circa 50 cicli della reazione di cui sopra. Ci vogliono circa 2-3 ore. Un risultato positivo della reazione non indica sempre lo stadio attivo della malattia, ma è un indicatore della presenza di un microrganismo nel corpo.

Vantaggi e svantaggi del metodo

In confronto ad altri metodi microbiologici, la PCR non impiega molto tempo per rilevare il Mycobacterium tuberculosis mediante PCR, il risultato può essere ottenuto il giorno del test.

Un altro vantaggio è l'elevata specificità dell'analisi, che consente di rilevare la presenza dell'agente patogeno con una precisione del 90-95% in quasi tutti i biomateriali (sangue, urina, feci, liquido cerebrospinale, espettorato, vampate di bronco).

Tuttavia, ci sono diversi svantaggi del metodo:

• una percentuale piuttosto alta di risultati falsi positivi (fino al 15%), che è associato alla rilevazione di microrganismi non viventi;
• in alcuni casi, si può saltare il fatto della malattia, dal momento che il Mycobacterium tuberculosis è spesso soggetto a mutazioni e ai suoi cambiamenti nel materiale genetico;
• bassa efficienza nell'esame delle persone con immunodeficienza;
• costo elevato della ricerca, la necessità di attrezzature costose e reagenti.

Cosa può essere sostituito?

Data la varietà di forme di infezione da tubercolosi, per una diagnosi più accurata e per la scelta del trattamento è necessario combinare diversi studi diagnostici:

L'analisi obbligatoria per i bambini è il test di Mantoux. Se l'introduzione della tubercolina (materiale genetico dei micobatteri) si verifica una reazione pronunciata, si può assumere un'infezione con un bacillo tubercolare.

I metodi a raggi X possono essere utilizzati per visualizzare l'attenzione patologica. Nella diagnosi di tubercolosi extrapolmonare, vengono utilizzati metodi endoscopici con biopsia simultanea:

• la broncoscopia aiuta a identificare le lesioni della laringe, della trachea, dei bronchi;
• colonscopia - intestini;
• cistouretroscopia: organi del sistema urinario;
• isteroscopia - genitali femminili. Questi metodi non sono specifici, per fare una diagnosi accurata, l'agente patogeno dovrebbe essere identificato.

Test clinici generali aiuteranno a determinare in modo più specifico le condizioni del corpo. È richiesto un emocromo completo con formula leucocitaria.

Un aumento del numero di neutrofili con un livello ridotto di linfociti e un aumento del tasso di sedimentazione degli eritrociti (ESR) indica un processo infiammatorio attivo di eziologia batterica. Per escludere danni agli organi del sistema urinario utilizzando un'analisi generale delle urine e la coltura per la sterilità.

La PCR è attualmente disponibile nella maggior parte dei laboratori privati. Ciò richiede non solo specialisti altamente qualificati, ma anche attrezzature costose, un gran numero di reagenti. Pertanto, l'uso di questo metodo è limitato nonostante la sua alta precisione e specificità.

Vantaggi e svantaggi della PCR (a) per la diagnosi di tubercolosi

Una specifica infezione da tubercolosi è presente da molti anni nei tessuti e nelle strutture umane e in determinate circostanze si diffonde rapidamente in tutto il corpo in 2-3 mesi. A volte il miglior trattamento è molto difficile da scegliere a causa della diagnosi tardiva e dell'adattamento del patogeno a molti farmaci.

L'ultima diagnosi di PCR della tubercolosi aiuta a rilevare non solo la malattia sviluppata, ma anche il patogeno stesso, quando i primi segni della malattia non sono ancora apparsi.

Cos'è la PCR?

La diagnosi di tubercolosi mediante PCR è apparsa di recente. Nel 1983, un microbiologo americano, Cary Mullis, inventò una procedura mediante la quale i microrganismi potevano essere ricostruiti da materiale biologico in un breve segmento. Questo lavoro ha guadagnato il premio Nobel.

La PCR per la tubercolosi è un processo a catena polimerica in cui la diagnosi e la rilevazione di agenti patogeni virali mediante ingegneria genetica. La tecnica è utilizzata in laboratori immunologici, microbiologici, virologici e biochimici.

Il metodo universale aiuta i medici a diagnosticare e identificare un processo infettivo anche dopo le prime ore di infezione, molto prima della comparsa dei sintomi. La ricerca è possibile anche con una piccola quantità di biomateriale.

Cosa è necessario per l'analisi?

• Diversi segmenti di DNA (primer), con cui inizia la sintesi biologica;
• Composti nucleotidici, la base della molecola di DNA o RNA;
• Un enzima polimerasi che accelera l'analisi della PCR.

Qual è la base del metodo?

In primo luogo, un segmento di DNA viene estratto da un biomateriale da una persona infetta, utilizzando i metodi di biosintesi del gene-molecolare, il tipo di microrganismi a cui appartiene il biofragment è ulteriormente determinato.

Questa complessa reazione richiede meno tempo di alcuni biometodi. La PCR determina l'agente patogeno in poche ore, mentre non è necessario isolarlo da un fluido biologico (espettorato, sostanza cerebrospinale o sangue), non è necessario farlo crescere a lungo su un mezzo nutritivo. È sufficiente che il materiale studiato contenga un filamento di DNA di un agente patogeno infettivo.

Quando si esegue un esame del sangue PCR per tubercolosi in vitro, la sintesi degli acidi ribonucleici del micobatterio tubercolosi viene creata artificialmente.

Fasi della diagnosi

La reazione molecolare mediante PCR è una procedura semplice che richiede poco tempo. Il biomateriale richiesto è preso: sangue, espettorato, liquido di lavaggio bronchiale sono usati per determinare il tbc.

1. In primo luogo, la forma primaria del DNA viene distrutta, 2 catene vengono separate ad alta temperatura (massimo 98 ° C per non più di 2 minuti);
2. Quindi viene eseguita la ricottura, la temperatura primaria viene ridotta di diverse divisioni, il filamento di DNA è collegato al primer;
3. Lo stadio successivo è chiamato allungamento, con la biosintesi delle strutture molecolari necessarie.

Per ottenere il numero richiesto di copie del DNA, da 25 a 30 tali cicli devono passare e il numero risultante di micobatteri è facilmente riconoscibile.

È necessario eseguire la PCR per la tubercolosi?

Direttamente a tutti i pazienti con TVC sospetta, la diagnostica a catena non viene eseguita, poiché la procedura richiede l'uso di costose apparecchiature. Non tutte le istituzioni dello stato medico ne consentono l'acquisto, soprattutto perché i metodi usuali di diagnosi del tubercolosi del micobatterio sono anch'essi informativi.

• Presa in carico accurata della storia, interrogando il paziente;
• Esame esterno;
• Test della tubercolina di Mantoux;
• Esame radiografico o fluorografico;
• Se necessario, diagnostica del computer;
• Esame microscopico o batteriologico della maschera con espettorato.

La PCR per tubercolosi viene eseguita solo quando non è possibile eseguire un'altra analisi strumentale o in circostanze difficili da diagnosticare.

Nonostante sia stato inventato un gran numero di metodi diagnostici, il numero di pazienti con tubercolosi continua a crescere. Inoltre, l'incidenza ha acquisito alcune caratteristiche: una forma grave della malattia è spesso osservata, il numero di morti aumenta, l'agente patogeno diventa resistente ai farmaci chemioterapici esistenti.

Molte persone non vogliono sottoporsi a un controllo di routine ogni anno, rifiutano la vaccinazione, il che porta ad un aumento dell'incidenza. Tali circostanze richiedono metodi di ricerca efficaci e informativi disponibili per adulti e bambini con diagnosi di TBC. La PCR ha vantaggi rispetto ad altri metodi diagnostici.

Qual è il valore del metodo?

Questa ultima ricerca si è dimostrata efficace. Se per una serie di ragioni è difficile fare una diagnosi o, in alcuni casi controversi, la PCR rileva il bacillo del tubercolo più facilmente nel materiale biologico rispetto ad altri metodi.

• Questo rapido studio, un piccolo segmento della molecola rende possibile effettuare una diagnosi accurata in poco tempo in circa 5 ore, questo viene utilizzato in casi di emergenza, ad esempio, prima di un intervento chirurgico urgente;
• Un esame del sangue per la tubercolosi è possibile quando altri metodi non sono disponibili o controindicati - a volte per il rilevamento del patogeno tbc, devono essere presi molti colpi di Rg, la dose di radiazioni è troppo grande;
• Usando la reazione della polimerasi, qualsiasi liquido biologico può essere esaminato per la presenza di micobatteri. Ad esempio, è possibile condurre uno studio sul fluido cerebrospinale con meningite tubercolare o urina con tubercolosi urogenitale;
• Il metodo è sicuro, la diagnosi di tubercolosi nei bambini che usano la PCR non causa difficoltà;
• Il metodo della reazione polimerica rivela un bacillo tubercolare in qualsiasi forma e stadio della malattia;
• La presenza di pochi batteri nel biomateriale consente di vedere la presenza di microrganismi, poiché si tratta di una reazione sensibile;
• PCR facilmente diagnostica la ricorrenza della malattia.

Nonostante l'enorme numero di vantaggi, tutti i pazienti con sospetto di studio tbc non sono fatti, poiché ci sono anche degli svantaggi, sono anche presi in considerazione.

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Video - diagnosi precoce

Quali sono gli svantaggi?

Questo metodo di diagnosi è piuttosto eccezionale che naturale, per questo ci sono delle ragioni. Prima di tutto, viene preso in considerazione l'alto costo del metodo. L'attrezzatura è costosa, le cliniche pubbliche non hanno la possibilità di acquistarlo a causa del prezzo elevato, ma la maggior parte dei laboratori pagati ha l'attrezzatura, vengono analizzati.

• Il metodo rileva i batteri morti che sono morti dopo il trattamento, mentre la PCR mostra un risultato positivo. Immediatamente dopo la chemioterapia, non ha senso condurre uno studio, poiché il risultato sarà inaffidabile;
• Le mutazioni del Mycobacterium tuberculosis sono suscettibili, il che porta all'inefficienza del metodo e il filamento del DNA non può essere sintetizzato in modo coerente.

L'ambiente per lo studio deve essere attentamente selezionato, sangue o urina possono essere raccolti solo se vi è il sospetto di infezione. L'espettorato non dovrebbe essere preso per l'esame se si sospetta tubercolosi ossea. In questa situazione, la diagnosi sarà errata.

Il sangue e l'urina di un paziente con tubercolosi da studiare su PCR sono raramente presi, l'identificazione della malattia in questo modo è discutibile. In questi media biologici, l'agente patogeno è determinato solo in sepsi o nel caso di tubercolosi disseminata. Le forme locali sono più comuni, con il loro sangue e le urine possono rimanere invariati. Il più spesso, la flemma è presa per esame.

Chi mostra l'analisi?

La maggior parte dei pazienti viene inviata per la diagnosi di PCR in casi controversi e difficili di tubercolosi. Quando i professionisti medici inviano referenze per la ricerca?

1. Se c'è un contatto con una persona che è stata diagnosticata in modo affidabile con la tubercolosi, ma è difficile da diagnosticare con metodi convenzionali;
2. In tali circostanze, se il paziente per fornire la clinica è impossibile per la radiografia o altre ricerche. In una situazione del genere, è più semplice ispezionarlo con il metodo del polimero. L'analisi dell'espettorato viene semplicemente consegnata al laboratorio in un apposito contenitore e il risultato diventa noto dopo poche ore;
3. Prima dell'operazione, è urgente determinare se il paziente è malato di tubercolosi, nel qual caso è indicata la PCR;
4. A causa della sicurezza del metodo, è possibile condurre un'indagine su una donna incinta o un bambino, senza creare un ulteriore carico radiografico;
5. Risultati dei test Mantoux dubbiosi.

Chiunque lo desideri può essere esaminato a pagamento se la tubercolosi non è stata confermata con l'aiuto della batteriologia e della fluoroscopia. Ciò accade se la lesione nel tessuto polmonare è invisibile nell'immagine Rg in una proiezione diretta e il paziente non è in grado di raccogliere correttamente l'espettorato, ma i segni della tubercolosi umana sono disturbati.

La moderna reazione PCR per la diagnosi è la chiave del successo del trattamento, a seguito della quale la prevalenza della malattia diminuisce. I metodi tradizionali di identificazione dei disturbi non sempre producono l'effetto desiderato.

L'analisi della PCR fino ad oggi è diventata uno dei metodi di diagnosi affidabili e sicuri nelle prime fasi della malattia.